NAT COMMUN IF17丨BRD9介导的染色质重塑抑制破骨细胞的发生（rankl诱导破骨细胞用什么试剂盒）

原标题：NAT COMMUN IF>17丨BRD9介导的染色质重塑抑制破骨细胞的发生

骨重塑过程是一个由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收的连续循环，一旦骨重塑过程紊乱，会扰乱骨骼结构，导致骨质疏松症、骨质疏松症、骨坏死等骨骼衰弱性疾病。

破骨细胞来源于骨髓巨噬细胞（BMDMs），是骨重塑过程的重要细胞，在形成过程中能够分泌蛋白酶和酸，如酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）、cathe- psin K（CTSK）和基质金属肽酶9（MMP9）等，进行骨吸收。已有研究报道BRD9在髓系谱系发育和巨噬细胞炎症反应中起着至关重要的作用，但BRD9介导的染色质重塑与骨稳态中破骨细胞谱系分化之间是否存在关联尚未明确。

2023年3月上海交通大学医学院上海市第九人民医院蒋欣泉教授的团队在《Nature Communications》期刊发表题为“BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism（BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨细胞形成）”的研究论文。研究证明了BRD9-FOXP1-STAT1轴在骨重塑过程中至关重要，另外作者设计的一种BRD9局部给药系统可有效缓解唑来膦酸钠（ZOL）相关的颌骨骨坏死（ONJ）和脂多糖（LPS）诱导的局部侵袭性牙周炎的急性骨质流失，强调了BRD9治疗骨病的潜力。值得一提的是，该研究中使用了汉恒生物提供的用于过表达STAT1和敲低FOXP1的慢病毒感染RAW264.7，以此来研究BRD9的作用机制。

首先，作者检测了BRD9在破骨细胞中的表达水平，发现BRD9在4周龄小鼠股骨远端骨小梁表面的破骨细胞中具有较高的表达水平（图1a）。骨微环境中的破骨细胞形成是由NF-κB受体激活因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）启动的，因此作者使用M-CSF和RANKL处理BMDMs，以进一步评估BRD9在破骨细胞增殖、分化和成熟阶段的表达水平（图1b）。作者发现，在破骨细胞形成过程中，经RANKL处理后，BRD9在mRNA和蛋白水平上的表达逐渐上调（图1c，d），在体外诱导RANKL后BMDM中BRD9的免疫荧光染色实验中也呈现出相同的结果（图1e）。为了进一步确认BRD9是否在破骨细胞发生过程中发挥关键作用，作者构建了特异性敲除了BRD9的小鼠（LysM-Cre；BRD9fl/fl小鼠）。μ显微CT分析显示，相比对照小鼠，LysM-Cre;；BrdRD9fl/fl小鼠4周龄时股骨小梁骨量有所减少，骨量/组织体积比（BV/TV）、骨量/组织体积比（BS/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨密度（BMD）降低，骨表面积/体积比（BS/BV）、骨小梁分离度（Tb.Sp）和孔隙率（Po）增加。LysM-Cre;；BRDrd9fl/f小鼠在4周龄时也表现出皮质厚度下降，横截骨面积（Ct.Ar）和周长（Ct.Pm）减少（图1f，g）。组织学上，H&E染色（图1h）和Von Kossa染色（图1i）结果显示，与对照小鼠相比，LysM-Cre;；BrdRD9fl/fl小鼠股骨远端骨量和矿化减少。以上实验结果表明BRD9缺失后会导致骨量减少。

图1髓系BRD9的缺失导致骨量减少

确认BRD9缺失后会导致骨量减少后，作者研究了破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成，发现LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠在4周龄时破骨细胞数量和大小增加，骨形成率与对照小鼠相当，但骨表面侵蚀更多，因此作者推断BRD9缺失后会促进破骨细胞形成。那么BRD9是如何抑制破骨细胞形成的呢？作者先是提取4周龄的LysM-Cre;Brd9fl/fl和对照小鼠的BMDMs，使用RANKL体外诱导破骨细胞，2天后，与对照BMDMs相比，敲除BRD9的BMDMs中TRAP水平升高，破骨细胞的数量和大小增加（图2a），破骨特异性基因Acp5、CTSK和MMP9的表达增加（图2b，c）。

接着作者使用BRD9的化学抑制剂iBRD9诱导破骨细胞形成，经过浓度摸索，最终选择了能够显著促进破骨细胞形成的浓度为1 μM（图2d，e，f）。作者使用M-CSF处理BMDMs，并设置了四组实验：对照组（M+vector），iBRD9诱导组（M+iBRD9），RANKL诱导组（MR+vector），RANKL和iBRD9同时诱导组（MR+iBRD9），并检测这4组BMDMs中FOS、CTSK的蛋白水平以及ACP5和MMP9的mRNA水平，结果显示抑制剂iBRD9在没有RANKL诱导的情况下对破骨细胞的形成没有显著影响，这表明BRD9发挥功能依赖于RANKL（图2g，h）。实验结果表明BRD9以负反馈机制对RANKL诱导的破骨细胞分化进行抑制调控，BMDMs中BRD9基因缺失和抑制均能促进破骨细胞分化。

图2 BMDMs中BRD9的缺失和抑制导致体外破骨细胞形成过度激活

为了进一步研究BRD9介导的抑制RANKL诱导破骨细胞分化的反馈机制，作者使用M-CSF和RANKL诱导破骨细胞，并分为两组，一组使用iBRD9（MR + iBRD9），另一组不做处理（MR +vector），1天后进行mRNA seq。结果显示，MR + iBRD9组BMDMs中共有211个基因下调和183个基因上调，如热图和散点图所示（图3a）。利用GO分析MR + vector和MR + iBRD9实验组，发现这些基因在免疫反应、对干扰素-β （IFN-β）和外部刺激的反应、免疫系统过程及其拓扑关系上都有强烈的富集（图3b）。基因集富集分析（GSEA）进一步发现，MR+iBRD9组IFN-β反应、乙酰胆碱受体信号传导、免疫受体活性显著减弱，而核糖体生物发生、突触传递和rRNA加工增强（图3c，d）。

在破骨细胞形成过程中，RANKL激活IFN-β信号，IFN-β、STAT1、STAT2上调（图3e），而iBRD9处理后，在RANKL诱导的BMDMs中，IFN-β信号活性下调（图3f）。因此，作者推测在BRD9抑制后，BMDMs中转录下调的IFN-β信号可能导致破骨细胞过度形成。为了验证这一假设，我们将IFN-β1细胞因子加入到BRD9抑制的BMDMs中，发现BRD9抑制后导致的破骨形成增加在IFN-β信号上调后得到控制，表现为Acp5和Mmp9的破骨生成基因表达下调（图3g），TRAP +分化的破骨细胞数量和大小减少（图3h）。因此，BMDMs中IFN-β信号的转录激活可能有助于破骨细胞发生过程中BRD9介导的负反馈。

图3 BRD9介导的干扰素- β信号的转录激活负调控破骨细胞的形成

为了阐明BRD9在RANKl处理的破骨细胞中的负反馈机制，作者通过chip-seq比较RANKl处理的iBRD9抑制基因转录与破骨细胞发生过程中BMDMs中BRD9的结合谱进行了比较。有717个基因在BRD9受到抑制后表达下调（图4a）。对上述基因进行KEGG富集分析，发现BRD9的关键转录调控在信号转导、信号分子、相互作用和免疫应答等通路富集（图4b）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析进一步确定了基因列表中的几个关键枢纽基因，是破骨细胞形成的负反馈调节过程中BRD9的潜在直接下游靶点（图4c）。其中，STAT1是相互作用次数最多的枢纽基因之一，在RNAKl诱导后，STAT1在体内和体外的破骨细胞中表达均有上调（图3e，4d，e）。而与对照组相比，在RANKl诱导后，LysM- Cre;Brd9fl/fl小鼠BMDMs中STAT1的表达下调（图4f），在BRD9抑制后，野生型小鼠BMDMs中STAT1的基因表达也下调（图4g和h）。接着作者构建了可稳定表达STAT1的RAW264.7，以研究iBRD9抑制剂的功能。作者发现，未表达STAT1且未使用iBRD9处理的对照组中，破骨相关基因MMP4、ACP4、FOS的表达量与表达STAT1且使用iBRD9处理实验组和表达STAT1但未使用iBRD9处理的实验组相当，但在未表达STAT1且使用iBRD9处理的RAW264.7中破骨相关基因的表达量明显上升（图4j）。另外作者发现iBRD9处理后，STAT1启动子和增强子的转录活性显著下降（图4k）。在破骨细胞诱导的RAW264.7细胞中进行ChIP-qPCR，结果显示BRD9可以直接结合STAT1的启动子和增强子（图4l）。以上实验结果表明BRD9通过直接调节STAT1的启动子和增强子活性来促进STAT1的转录。

图4 STAT1对破骨细胞发生过程中BRD9介导的负反馈至关重要

然后，作者进行了染色质转座酶开放性高通量测序（ATAC-seq）和基序分析，来研究BRD9的染色质重塑功能以及可能促进BRD9对破骨细胞产生负作用的辅助因子。BRD9抑制组染色质开放性谱发生了显著变化，对照组有12988个峰，BRD9抑制组有10795个峰，其中重叠峰有5092个（图5a，b）。进一步比较两组间的差异开放区域（DARs）， BRD9抑制后得到3155个DARs开放性增加，2489个DARs开放性降低（图5c）。BRD9抑制后染色质开放图谱的变化表明，除了IFN-β信号通路外，BRD9介导的破骨细胞发生的负调控也可能被多个过程影响。

为了确定破骨细胞形成过程中BRD9潜在的相互作用转录因子，作者使用ATAC-seq（图5e）将BRD9抑制后最富集的缺失基序与ChIP-seq中BRD9结合位点富集基序进行比较。在BRD9结合位点富集而BRD9抑制后缺失的基序有：MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1等，这些TF可能与BRD9相互作用（图5f）。作者发现FOXP1在股骨远端生长板下的分泌CTSK的破骨细胞和正常破骨细胞中表达（图5h，i）。因此，作者推测FOXP1可能在破骨细胞形成过程中参与BRD9的抑制功能。作者先做了IP实验，发现BRD9和FOXP1在破骨细胞分化过程中相互作用（图5j）。为了进一步验证FOXP1在STAT1上的结合和转录调控功能，作者利用进行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低实验。实验结果显示FOXP1可以直接结合STAT1启动子和增强子，而FOXP1在STAT1上的结合功能在BRD9抑制后减弱（图5k）。利用慢病毒敲低Foxp1导致Stat1下调，同时与对照慢病毒组相比，破骨细胞分化基因上调，BRD9的调控功能起效（图51）。我们进一步排除了BRD9缺失或抑制后Foxp1基因表达下调导致Stat1结合和调节功能受损的可能性，如在rankl诱导后LysM-Cre;BRD9fl/fl小鼠中Foxp1基因表达与对照小鼠相比相当（图5m），以及在BRD9抑制后野生型小鼠的BMDMs中Foxp1基因表达水平无明显变化（图5n）。以上结果表明FOXP1是BRD9在STAT1转录激活及其在破骨细胞分化过程中的负反馈调控的关辅助因子之一（图5o）。

图5 FOXP1与BRD9相互作用，在破骨细胞形成过程中调节STAT1转录

ZOL相关的ONJ与拔牙后患者破骨细形成过程受损有关，需要长期服用强抗骨吸收剂。此外，最近的研究也揭示了ONJ的发病机制也与巨噬细胞过度活化和炎症有关。先前有研究证明了化学药物PROTAC dBRD9（dBRD9降解剂）在滑膜肉瘤和白血病的临床前模型中的疗效，因此，作者推测使用具有促进破骨细胞形成和抗炎反应的dBRD9降解剂（这个降解剂是PROTAC吗[1] ）进行局部治疗可以有效预防或减轻ONJ。为了验证这一假设，作者给6周龄WT C57BL/6J小鼠注射ZOL（125 μg/kg体重；每周2次）和DEX（糖皮质激素/地塞米松）（5mg /kg体重；每周一次）。首次注射ZOL/DEX 2周后，拔除小鼠上颌左第一磨牙。接着，作者构建了含有dBRD9降解剂的改良光固化SF（丝素蛋白）材料，在拔牙后立即填充到牙槽骨窝中，并以SF空载为对照组。两周后，收集各组上颌骨进行评估（图6a）。

显微CT成像评估牙槽骨愈合情况显示，onj对照组小鼠的磨牙拔牙部位骨膜反应严重（图6b，箭头1），上颌窦底骨过度（图6b，箭头2），骨填充量不足充满骨屑，骨硬化严重（图6b，箭头3）。而来自ONJ-dBRD9组的小鼠的磨牙拔牙槽内长满了新形成的小梁骨（图6b），与onj 对照组的小鼠相比，骨坏死和骨膜反应的发生率降低了60%（图6c）。组织学检查结果显示，对照小鼠坏死的牙槽骨有空腔隙（图6d，星号），而dBRD9组无明显空腔隙，且愈合的拔牙窝骨组织结构组织良好（图6d，箭头）。

TRAP染色和定量分析显示，与对照组相比，dBRD9降解剂处理组在愈合的牙槽骨表面参与骨重塑的破骨细胞局部增加（图6e，f）。TNF-α（图6h）和CD66（图6i）显示，与对照组相比，dBRD9降解剂治疗组拔牙槽愈合后骨表面炎症反应局部减轻。

应用dBRD9治疗ZOL诱导的ONJ效果良好，这一结果促使作者进一步探索在破骨细胞生成和巨噬细胞激活过程中，BRD9的功能与发病机制之间的潜在联系。在rankl诱导的破骨细胞生成和脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞激活过程中，ZOL处理可导致bmdms中BRD9的表达上调（图6j），而STAT1作为BRD9的关键下游靶点之一，在dBRD9降解剂处理组体内较对照组下调（图6k）。因此将dBRD9应用于zol诱导的ONJ是一种潜在的理想的治疗方法，为未来长期服用ZOL的患者预防或有效缓解ONJ提供了一个新的治疗方向。

图6 BRD9降解物减轻拔牙后ZOL相关的ONJ

我们以LPS诱导的牙周牙槽骨损失为模型，评估brd9缺失小鼠骨组织中炎症反应和RANKL表达以及破骨细胞活性的变化（图7a）。与对照小鼠相比，携带骨质疏松表型（图7b，c，星号）的Brd9缺失小鼠对LPS/结扎刺激的牙周牙槽骨局部急性损伤（图7b-d）和破骨细胞活性（图7e，f）表现出抵抗性。如TNF-α、iNOS和RANKL的免疫荧光染色结果所示（图7g），与对照小鼠相比，LysM-Cre;BRD9fl/fl小鼠对LPS/结扎刺激的高炎症反应的抵抗和RNAKL的增加可能缓解了急性局部骨损失，降低了破骨细胞活性。

为了测试dBRD9对LPS/结扎诱导的急性牙周炎和牙槽骨丢失的预防和治疗潜力，作者进一步利用含有BRD9降解物的改性光固化SF，并在LPS/结扎诱导时将其注射到牙周组织中，对侧含有SF的载体（图7h），5 d后收集各组牙槽骨进行评估。结果显示，与对照组相比，dBRD9组LPS/结扎刺激的牙周牙槽骨急性局部骨丢失（图7i-k）、破骨细胞活性（图7l，m）以及巨噬细胞激活和RANKL表达（图7n，o）明显减弱。这些结果表明，在感染刺激的情况下，骨组织中BRD9缺失或降解的抗炎作用可能比在基础条件下更为突出。

图7 BRD9缺失/降解物减轻脂多糖诱导的骨吸收

综上，该研究确定了BRD9-FOXP1-STAT1轴，BRD9与转录因子FOXP1相互作用，激活STAT1转录和IFN-β信号转导，这对维持破骨细胞负反馈循环和骨重塑的稳态是不可或缺的。同时，作者设计了BRD9局部给药系统，小鼠实验结果显示该给药系统可有效减轻ZOL相关的ONJ和减轻脂多糖诱导的局部侵袭性牙周炎的急性骨质流失。以上结果阐明了BRD9在破骨细胞中的功能及其对骨病的治疗潜力，为未来开发破骨细胞相关骨病的治疗策略提供了新的见解。返回搜狐，查看更多

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